Henri de Guise était le fils aîné de François de Guise, deuxième duc de Guise, assassiné en 1563 par un gentilhomme protestant. Il fut placé sous le tutelle de son oncle Charles, cardinal de Lorraine qui se chargea de son éducation. Soucieux de son apprentissage militaire, le cardinal le poussa à voyager en Europe pour acquérir de l'expérience. Quand il revint en France, le duc de Guise devenu adulte, s'apprêta à devenir le chef de la maison de Guise, en représentant l'opposition catholique face au parti protestant. C'est ainsi qu'il participa activement aux deuxième et troisième guerres de religion, aux cotés d'Henri, duc d'Anjou (le futur Henri III). Il s'illustra aux batailles de Jarnac (13 mars 1569) et de Moncontour (3 octobre 1569) et acquérit une renommée importante.
Ambitieux, le duc de Guise espérait épouser la princesse Marguerite de France. Cette alliance qui n'était pas du goût de la reine mère, ne se fit pas. Henri de Guise épousa donc, le 4 octobre 1570, Catherine de Clèves, comtesse d'Eu et princesse de Château-Renault, fille de François Ier, duc de Nevers.
Le duc joua un rôle important dans l'assassinat de l'amiral Gaspard de Coligny, chef de file du parti protestant (1572), probablement commandité et organisé par ses oncles, le duc d'Aumale et le cardinal de Lorraine, véritables chefs de la maison des Guise. Durant la nuit de la Saint Barthélémy, le 24 août 1572, Henri de Guise prit la tête des hommes qui étaient chargés d'exécuter les principaux chefs protestants. Il vit donc mourir défenestré celui qu'il considérait comme l'assassin de son père. Il pourchassa également les protestants logés sur la rive sud qui s'échappèrent hors de Paris par une porte non gardée. Le duc de Guise n'était donc pas à Paris quand commença le massacre de la Saint-Barthélemy : il n'y revint que le lendemain, bredouille dans sa course après Montgommery qui put s'échapper.
Par la suite, il continua d' être le pilier du catholicisme intransigeant. Après une blessure reçue au visage lors de la bataille de Dormans (10 octobre 1575), il fut surnommé « le Balafré » (comme son père). Après la paix de Beaulieu, il créa la Sainte Ligue – dont il devint le chef –, fermement opposé à tout compromis avec les protestants. À ce titre, il signa le traité de Joinville avec le roi Philippe II d'Espagne en 1582, en vertu duquel ce dernier apportait son soutien financier à la Ligue.
Il fut l'un des promoteurs du traité de Nemours (7 juillet 1585) par lequel Henri III révoqua l'édit de pacification et relanca la guerre contre les protestants. Lors de la huitième guerre de religion, alors à la tête des troupes catholiques, il vainquît successivement les protestants à Vimory (26 octobre 1587) puis à Auneau (24 novembre 1587).
Revenu à Paris le 9 mai 1588 malgré l'interdiction formelle du roi, il prit une part très active dans la Journée des Barricades (12 mai 1588) à la suite de laquelle, fort de son succès, il contraint Henri III à signer l'édit d'Union (15 juillet 1588) par lequel il devenait lieutenant général des armées du royaume.
Le 23 décembre 1588, à l'occasion de la réunion des États généraux au château de Blois, il fut assassiné sur l'ordre d'Henri III, dans la propre chambre de ce dernier, par des membres des « Quarantes-cinq », la garde personnelle du roi.
Son corps fut brûlé dans une des salles du château et ses cendres dispersées dans la Loire. Le même jour, son fils Charles fut arrêté. Son frère Louis, cardinal de Lorraine, représentant du clergé aux États généraux, fut assassiné le lendemain.
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